蛋白穩定性分析時大分子聚集狀態解析
點擊次數：22 更新時間：2025-10-20
在生物制藥、食品工業和基礎研究中，蛋白質穩定性是衡量其功能與壽命的核心指標。然而，許多蛋白在儲存、運輸或加工過程中會“抱團”形成聚集體，這些從納米級寡聚體到微米級顆粒的“大分子俱樂部”，往往直接導致藥效下降、免疫原性上升或溶液渾濁。如何看清這些聚集體的“真身”，成為蛋白穩定性分析的關鍵戰役。
一、為什么聚集是穩定性“紅燈”？
蛋白質聚集本質上是疏水核心暴露后分子間“牽手”的結果。溫度波動、pH漂移、離子強度變化或表面吸附，都可能讓原本折疊緊湊的蛋白展開，暴露β-片層等“粘性”區域。一旦形成二聚體、三聚體，就像滾雪球般形成不可逆纖維（如淀粉樣纖維）或無定形顆粒。研究顯示，單抗藥物中只要0.01%的聚集體，就可能觸發患者免疫反應，導致療效喪失。
二、傳統“放大鏡”的盲區
早期分析依賴SDS-PAGE或SEC（尺寸排阻色譜），只能檢測變性后或稀釋狀態下的聚集體，容易低估真實水平。如SEC可能因柱材吸附導致弱結合寡聚體“漏網”；而濁度法雖能感知顆粒，卻無法區分蛋白聚集與脂質氣泡。更棘手的是，亞可見顆粒（0.1–10μm）恰好處于光學顯微鏡與光散射的“盲區”，如同隱形危機。
三、新技術給聚集體拍“CT”
1.非對稱流場-流分離
像“分子跑步機”般按流體力學半徑分離，可原位檢測未稀釋樣品中的nm-μm級聚集體，避免SEC的剪切力破壞。聯用多角度光散射，直接計算分子量，區分“緊密球”與“松散鏈”。
2.納米顆粒跟蹤分析
通過激光散射追蹤單個顆粒的布朗運動，像“星空攝影”般統計0.01–1μm顆粒的濃度與粒徑分布，彌補流式細胞術對蛋白顆粒的靈敏度不足。
3.微流控擴散篩選
利用芯片上微尺度擴散差異，在原生條件下（無需標記）區分單體與寡聚體，僅需5μL樣品，10分鐘完成掃描，成為早期配方篩選的“快檢利器”。
4.冷凍電鏡
對“疑難雜癥”如可逆寡聚體，通過快速冷凍捕獲瞬時結構，近原子級分辨率揭示聚集界面。
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