2025年3月。河南大學抗體藥物開發技術國家地方聯合工程實驗室的科研工作者于在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上發表“Attenuation of cardiac ischemia/reperfusion injury via the decoy receptor DcR2 by targeting the PLAD domain of the death receptor DR5"論文。

本研究旨在確定 DcR2 的作用靶點，并探究 DcR2 在小鼠心肌 I/R 損傷中的保護機制。結果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白對心肌缺血/再灌注損傷具有顯著的保護作用。DcR2 通過其 PLAD 結構域與 DR5 形成異源復合物，該結構域不具有完整的死亡結構域，因而無法向下游傳遞信號。此外，復合物的形成掩蓋了與配體 TRAIL 相互作用的位點，從而減輕了缺血/再灌注損傷后的心肌細胞死亡。因此，本研究揭示了 DcR2 的 PLAD 結構域在抑制細胞凋亡中起關鍵作用，為新型藥物的研發提供了潛在靶點。

Lijie Zhang, Xinyuan Zhang, Ziting Li, Tingting Mo, Wanting Feng, JingLun Zhang, Dan Zhao, Ying Wang, Yinxiang Wei, Yaohui Wang

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, the First Affiliated Hospital, Henan University, Kaifeng, China

School of Medicine, Henan University, Kaifeng, China

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, Henan University, Kaifeng, China

Zhou, D. et al.

蛋白質的熱穩定性是指蛋白質多肽鏈在溫度影響下的形變能力，主要體現在溫度改變時多肽鏈的化學特性和空間構象的變化，變化越小熱穩定性越高。蛋白質的熱穩定性受到不同溫度、pH值、離子強度等外界因素的影響，在生物技術、藥物研發以及食品工業等領域，具有重要意義。

蛋白質變性溫度是生物學家們研究蛋白質的熱穩定性的一個重要的概念，是指蛋白質在特定溫度條件下受到熱力作用時，其結構發生變化的溫度點，一般溫度較高時，蛋白質從穩定的三維結構變化成松散的無序結構。蛋白質的熱穩定性一般使用熱變性中點溫度（Tm）來表示，即蛋白質解折疊50% 時的溫度。

前言

缺血缺氧導致的心肌細胞死亡是心肌損傷的主要原因。DcR2 是 TRAIL 的誘騙受體，DcR2 在心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中的作用尚不清楚。近期研究表明，DcR2 不僅作為受體與 TRAIL 結合，還能作為 DR5 的配體在體外阻斷 TRAIL 誘導的細胞凋亡，但 DcR2 在體內對 TRAIL 或 DR5 的親和力偏好尚不清楚。我們的研究發現，hDcR2-Fc 融合蛋白在小鼠心肌 I/R 損傷模型中發揮心臟保護作用，通過減少細胞凋亡來實現。親和力測定表明，DcR2 對 DR5 的親和力大于對 TRAIL 的親和力，且 DcR2 更傾向于與 DR5 結合。機制研究表明，PLAD 的缺失消除了 hDcR2-Fc 對 I/R 引起的心肌損傷的保護作用。DcR2 通過類似的 PLAD 結構域與 DR5 形成異源復合物。綜上所述，本研究揭示了 DcR2 可通過 PLAD 結構域靶向 DR5 形成異源復合物，阻斷細胞凋亡，從而改善心肌 I/R 損傷，為心肌 I/R 損傷的治療提供了新的預防策略。

01 簡介

急性心肌梗死（AMI）是一種嚴重威脅人類生命健康的疾病，全球范圍內 AMI 的死亡率仍然很高。由缺血缺氧引起的心肌細胞死亡是一種不可逆的損傷。經皮冠狀動脈介入治療（PCI）能有效降低急性心肌梗死患者的死亡率，但存在兩大難題，即治療的黃金時間短以及缺血/再灌注（I/R）損傷。此外，長期心力衰竭的發生率也很高。為了縮小心肌梗死的范圍，延長心肌細胞死亡的“窗口期"，改善患者的長期預后，需要研發能夠減少或逆轉心臟損傷的新療法。

心肌梗死通常伴有多種病理變化，其中最嚴重的是心肌細胞凋亡。然而，臨床上尚無治療心肌細胞凋亡的有效策略。因此，尋找預防心肌細胞凋亡的關鍵靶點可能為心肌梗死的預防和治療提供新的策略。腫瘤壞死因子（TNF）相關凋亡誘導配體（TRAIL），也稱為Apo2配體，屬于TNF配體超家族。迄今為止，人類已鑒定出五種TRAIL受體。DR4（TRAIL-R1）和DR5（TRAIL-R2）被稱為死亡受體（DRs），它們具有完整的死亡結構域（DD），能夠傳遞由TRAIL調節的死亡信號。DRs介導相關下游信號通路的激活，從而導致細胞凋亡，其中DR5是主要的死亡受體。我們之前的研究證實sDR5-Fc融合蛋白可以特異性阻斷TRAIL-DR5通路，從而改善猴、豬、大鼠心肌梗死后的心功能。

誘騙受體 1（DcR1）、誘騙受體 2（DcR2）和骨保護素（OPG）是已知的誘騙受體，它們缺乏功能性的死亡結構域，不能傳遞凋亡信號，從而保護細胞免受 TRAIL 誘導的死亡 [12,13]。目前關于 DcR2 的研究主要集中在它在各種腫瘤細胞 TRAIL 耐藥機制中的作用上。抗凋亡在心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中起著重要作用，但 DcR2 在心肌 I/R 損傷中的作用尚未見報道。近期研究表明，DcR2 不僅作為受體與 TRAIL 結合，還在體外作為 DR5 的配體來阻斷 TRAIL 誘導的細胞凋亡 [14-16]。DcR2 通過位于 TNFR 氨基末端的富含半胱氨酸結構域 1（CRD1）的重疊區域——前配體組裝結構域（PLAD）與 DR5 相互作用，形成無功能的異源復合物。DcR2 在體內更傾向于與 TRAIL 還是 DR5 結合尚不清楚。在本研究中，我們旨在確定 DcR2 的作用靶點，并探究 DcR2 在小鼠心肌 I/R 損傷中的心肌保護機制。結果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白對心肌缺血/再灌注損傷具有顯著的保護作用。DcR2 通過其 PLAD 結構域與 DR5 形成異源復合物，該結構域不具有完整的死亡結構域，因而無法向下游傳遞信號。此外，復合物的形成掩蓋了與配體 TRAIL 相互作用的位點，從而減輕了缺血/再灌注損傷后的心肌細胞死亡。因此，本研究揭示了 DcR2 的 PLAD 結構域在抑制細胞凋亡中起關鍵作用，為新型藥物的研發提供了潛在靶點。

02 材料與方法

2.1. 蛋白質表達與純化

為了獲得具有高生物活性的融合蛋白，在人 DcR2 的 C 末端和 N 末端構建了帶有 Fc 標簽的重組質粒。合成了編碼人 DcR2 胞外區（1-156）的基因，并通過重疊 PCR 獲得了 hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 片段。將 hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 分別插入到具有 HindIII/EcoRI 和 BamHI/XhoI 限制性內切酶位點的 pcDNA3.1 質粒中。這些重組質粒被瞬時轉染到 293F 細胞中進行真核表達。在轉染后 5 天收集細胞上清液，并通過蛋白 A 親和層析純化 hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 融合蛋白。合并峰值組分，并通過 SDS-PAGE 和 Western blotting 進行評估。

通過重疊 PCR 構建了 PLAD 區域缺失的重組質粒 pcDNA3.1-DcR2ΔPLAD-Fc，利用 Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2（C215，Vazyme）構建了 N 連接糖基化位點突變的重組質粒 pcDNA3.1-Mu-N-Gly-DcR2-Fc。隨后按照 hDcR2-Fc 蛋白的表達和純化方法獲得了這兩種蛋白。通過 PCR 構建了 pcDNA3.1-hDcR2-His 重組質粒，將其轉染至 293F 細胞培養 5 天，收集細胞上清液。通過鎳親和柱純化重組 hDcR2-His 蛋白。

2.2.  Western blotting印跡法

在蛋白質表達和純化過程中收集并制備了蛋白質樣本。在蛋白酶/磷酸酶抑制劑存在的情況下，將心臟組織在裂解緩沖液中勻漿。通過二喹啉甲酸（BCA）法（AR0197，博士德）對蛋白質樣本進行定量。將樣本通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用 5%脫脂奶粉封閉，然后依次用指定的一抗和二抗進行孵育。隨后通過增強化學發光法檢測免疫反應蛋白，并通過 ImageJ 軟件進行分析。用于蛋白質印跡分析的抗體包括：抗人 IgG Fc 片段抗體
（ab97225，Abcam，1:2000 稀釋），抗 TRAIL（PA5-80165，Thermo Fisher，1:500 稀釋），抗 DR5（ab8416，Abcam，1:500 稀釋），抗 DcR2（A3581，ABclonal，1:500 稀釋），抗裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（9664，Cell Signaling Technology，1:1000 稀釋），抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 8（ab25901，Abcam，1:1000 稀釋），抗 Bak（3814，Cell Signaling Technology，1:1000 稀釋），抗 Bcl-2（15,071，Cell Signaling Technology，1:1000 稀釋）以及抗 GAPDH（AC002，ABclonal，1:5000 稀釋）。

2.3. 在Jurkat細胞中進行的細胞凋亡及細胞凋亡阻斷實驗

Jurkat 細胞在含 L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉的 1640 培養基中培養。將 Jurkat 細胞以每孔 5 ×10-5 個細胞的密度接種于 12 孔板中，再培養 6 小時。加入 TRAIL 蛋白（200 ng/mL）誘導細胞凋亡，在細胞凋亡阻斷實驗中，同時將 hDcR2-Fc、DcR2ΔPLAD-Fc 和 Mu-N-Gly-DcR2-Fc 與 TRAIL 共同孵育。隨后，用 Annexin V-APC 和 7-AAD（杭州多瑞生物科技有限公司）對細胞進行標記，然后進行流式細胞術分析。

2.4. 小鼠的 I/R 模型生成、梗死面積及組織學檢查

雄性 C57BL/6N 小鼠（6 - 8 周齡，20 - 22 克）飼養于河南大學動物中心（中國開封），自由采食飲水。適應一周后，將小鼠隨機分為三組（每組 6 只）：假手術組（sham）、缺血再灌注 + PBS 組（I/R + PBS）和缺血再灌注 + 人 DcR2-Fc 組（I/R + hDcR2-Fc）。通過結扎左前降支冠狀動脈（LAD）40 分鐘構建缺血再灌注損傷模型，手術后松開結扎線，再灌注 24 小時。假手術組小鼠接受相同的手術操作，但不結扎冠狀動脈。通過尾靜脈注射單劑量的人 DcR2-Fc。冠狀動脈再灌注后，將結扎線松開置于心臟表面。再灌注 24 小時后，取出小鼠心臟并切成小塊。用 1% 三苯基氯化四氮唑（TTC）（美國西格瑪奧德里奇公司）在 37℃ 下染色 20 分鐘確認心肌梗死，通過主動脈注射伊文思藍確定危險區域（AAR）。通過 ImageJ 軟件測量心肌梗死面積（IS）。所有研究均獲得河南大學動物護理與使用委員會的批準，并遵循美國國立衛生研究院（NIH）關于動物護理和使用的指南。

2.5. 小鼠心臟的組織學分析

心臟組織用 4%多聚甲醛固定 48 小時，然后包埋于石蠟中，并切成 5 微米厚的連續切片。切片在 65℃烘箱中烘烤 2 小時后，進行脫蠟和水化處理。切片用蘇木精-伊紅染色液（上海金穗公司，JR20570）進行 HE 染色。染色完成后，通過顯微鏡（奧林巴斯 IX53）對病理切片進行拍照。
采用 TUNEL 染色法（A113，TUNEL 凋亡檢測試劑盒，Vazyme）分析細胞凋亡情況，操作步驟依照制造商說明進行。將心臟組織脫蠟、水化，用蛋白酶 K 透化，于 37℃反應緩沖液中處理 60 分鐘，然后用 DAPI（C0060，索萊寶）復染 5 分鐘。在熒光顯微鏡（尼康 A1R Storm）下觀察 TUNEL 染色陽性信號。

免疫組化染色時，將重新水合的切片在室溫下用 3% H?O? 孵育 20 分鐘，隨后用檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）處理以修復抗原。切片在室溫下用封閉緩沖液（5% BSA）封閉 30 分鐘，然后在 4 ?C 下與針對裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（9664，CST，1:2000 稀釋）、TRAIL（PA5-80165，Thermo Fisher，1:500 稀釋）和 DcR2（A3581，ABclonal，1:50 稀釋）的一抗孵育過夜。切片通過 3,3'-用四鹽酸鹽二氨基聯苯胺（DAB）（8059，Cell Signaling Technology 公司）進行染色，然后用蘇木精復染，再經過脫水處理后封片。通過光學顯微鏡（奧林巴斯 IX53）觀察染色切片，并使用 ImageJ 軟件進行分析。

2.6. 多柔比星誘導的急性心臟毒性模型及超聲心動圖（Echo）

經過一周的適應期后，將 6 - 8 周齡、體重 20 - 22 克的雄性 C57BL/6 小鼠隨機分為三組（每組 6 只）：對照組（正常組）、多柔比星治療組（多柔比星組）和多柔比星治療聯合人 DcR2-Fc 注射組（多柔比星 + hDcR2-Fc 組）。多柔比星組和多柔比星 + hDcR2-Fc 組小鼠接受腹腔注射多柔比星（20 毫克/千克；美中生物），而正常組則注射等量的 PBS。多柔比星 + hDcR2-Fc 組在多柔比星給藥前一天和給藥當天接受靜脈注射 DcR2-Fc（8 毫克/千克），而多柔比星組則注射等量的 PBS。在多柔比星給藥后 4 天，通過經胸超聲心動圖檢測心臟功能。使用 Visual Sonics Vevo 1100 成像系統（Visual Sonics 公司）進行經胸超聲心動圖檢查，采用 30 兆赫的探頭（MX400）。所有小鼠均在 1.5% 異氟烷和 100% 氧氣的麻醉下進行檢查，在乳頭肌水平獲取二維靶向 M 型軌跡。測量左心室收縮期和舒張期后壁及前壁的厚度。所有參數均在至少連續 6 個心動周期內進行測量。采用平均值來計算左心室射血分數和左心室短軸縮短率。

2.7. BLI 檢測

通過 Octet R8 儀器測量蛋白質 - 蛋白質相互作用。將帶有 Fc 標簽的 hDR5-Fc 固定在 AHC 生物傳感器芯片上，然后以不同濃度結合 hTRAIL（h，人）和 hDcR2-His 蛋白質。同樣，將帶有 Fc 標簽的 hDcR2-Fc 固定在 AHC 生物傳感器芯片上，然后以不同濃度結合 hTRAIL 和 mTRAIL（m，小鼠）蛋白質。將帶有 His 標簽的 hTRAIL 固定在 His1k 生物傳感器芯片上，然后以不同濃度結合 DcR2ΔPLAD-Fc 和 Mu-N-Gly-DcR2-Fc 蛋白質。同樣，將帶有 His 標簽的 mTRAIL 固定在 His1k 生物傳感器芯片上，然后測定不同濃度的 hDR5-Fc 蛋白質的結合情況。使用 Octet 數據分析軟件將數據擬合到 1:1 結合模型中，以提取結合和解離速率。通過 Koff/Kon 比值計算 KD 值。

2.8. 蛋白熱穩定性研究

融合蛋白的熱穩定性通過 PSA-16 型儀器（北京佰司特科技有限責任公司）測定[17]。將樣品稀釋至 0.5 毫克/毫升，取 20 微升稀釋后的樣品裝入石英玻璃管（貨號：LG-002，北京佰司特科技有限責任公司）。在 30 至 90 攝氏度的線性溫度掃描范圍內，以每分鐘 1 攝氏度的升溫速率測量 330 納米和 350 納米處的固有蛋白質熒光強度。根據 F350/F330 曲線的斜率計算熱變性中點（Tm）。每個樣品測量三次。

2.9. 數據分析

結構圖示通過 PyMOL生成。不同蛋白質的氨基酸序列通過 Clustal Omega進行比較。所有數據均來自至少 3 次獨立實驗，并以平均值 ± 平均值的標準誤差（SEM）表示。兩組之間的統計比較通過學生 t 檢驗進行。組間差異通過分析得出。
通過單向方差分析（one-way ANOVA）并采用 Dunnett 檢驗進行后續分析。統計分析使用 GraphPad Prism 9.5 版軟件完成。所有分析中，P < 0.05 被認為具有顯著差異。

03 結果

3.1. DcR2 融合蛋白的制備與表征

為了比較 Fc 標簽位于 N 端和 C 端對 DcR2 功能的影響，同時構建了 C 端和 N 端帶有 Fc 標簽的 pcDNA3.1-hDcR2-Fc 和 pcDNA3.1-Fc-hDcR2 重組質粒（圖 1A）。隨后將 pcDNA3.1-hDcR2-Fc 重組質粒轉染到 293F 細胞中進行擴增培養，并通過蛋白 A 親和層析進行蛋白純化（圖 1B）。結果表明，hDcR2-Fc 以二聚體形式存在。通過凝膠層析進一步純化發現，hDcR2-Fc 是一種大小在 45 至 75 kDa 之間的糖蛋白，這與理論分子量相符（圖 1C）。同樣通過蛋白 A 親和層析對 Fc-hDcR2 進行了真核表達純化（圖 1D）。結果表明，Fc-hDcR2 為糖蛋白，大小在 45 至 75 kDa 之間，表明 Fc-hDcR2 蛋白已成功獲得。

流式細胞術表明，hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 均能有效阻斷 TRAIL 誘導的 Jurkat 細胞凋亡，且阻斷效果隨蛋白濃度的增加而增強（圖 1E）。hDcR2-Fc 的阻斷效果優于 Fc-hDcR2，因此后續實驗均使用 hDcR2-Fc。

3.2. hDcR2-Fc 可減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷并改善心臟功能

為了確定 hDcR2-Fc 在心肌缺血再灌注損傷中的作用，通過結扎 C57BL/6N 小鼠的左前降支（LAD）動脈 40 分鐘，隨后再灌注 24 小時來誘導心肌缺血，并在再灌注前 5 分鐘通過靜脈注射不同濃度的 hDcR2-Fc 或 PBS。PBS 作為對照。整個實驗過程為雙盲實驗。通過 TTC-伊文思藍染色評估 hDcR2-Fc 對小鼠心肌梗死面積的影響（圖 2A）。與 PBS 組相比，用 hDcR2-Fc 處理的小鼠心肌梗死面積顯著減小，且 hDcR2-Fc 在體內的保護作用呈劑量依賴性（圖 2B）。用 8 毫克/千克 hDcR2-Fc 融合蛋白處理可使梗死面積減少最多，用 8 毫克/千克 hDcR2-Fc 處理的小鼠心肌梗死面積/危險區面積（IS/AAR）比值降低了 30.48%，而梗死面積/左心室面積（IS/LV）比值降低了 18.65%。結果表明，hDcR2-Fc 通過減少心肌缺血再灌注損傷來發揮心肌保護作用。HE 染色結果顯示，缺血再灌注（I/R）損傷所導致的病理損害，如心肌細胞肥大和炎癥細胞浸潤，在經 hDcR2-Fc 治療后顯著改善（圖 2C）。這些數據表明，hDcR2-Fc 能夠減輕 I/R 損傷所誘導的細胞凋亡程度，并改善心肌損傷。

我們之前的研究報告稱，心肌缺血再灌注（I/R）損傷后，TRAIL 和 DR5 的表達上調[11]。為了進一步探究 hDcR2-Fc 如何發揮心肌保護作用，我們檢測了心肌 I/R 損傷小鼠中 TRAIL、DR5 和 DcR2 的表達情況。免疫組化結果和蛋白質印跡分析發現，I/R 損傷后小鼠梗死區 TRAIL、DR5 和 DcR2 的蛋白水平顯著升高（圖 2D-G）。hDcR2-Fc 可降低心肌梗死區 TRAIL 的表達，并上調 DcR2 的表達。

3.3. hDcR2-Fc 通過阻斷細胞凋亡途徑發揮心肌保護作用

抗凋亡在心肌缺血/再灌注損傷中起著重要作用，我們接下來研究了人 DcR2-Fc 融合蛋白對細胞凋亡相關通路的影響。促凋亡蛋白裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8、Bak 和 Bax 的表達顯著增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達則顯著降低（圖 2G-I）。此外，hDcR2-Fc 可逆轉這些表型。通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記（TUNEL）檢測和 HE 染色來檢測心肌梗死組織中的細胞凋亡情況并評估病理變化（圖 2J）。與假手術組相比，心肌缺血/再灌注損傷后凋亡心肌細胞的數量顯著增加，而使用 hDcR2-Fc 治療則顯著減少了凋亡心肌細胞的數量。總之，結果表明 hDcR2-Fc 可通過內在和外在途徑抑制細胞凋亡的激活。

為了通過抑制細胞凋亡來確定 DcR2-Fc 在其他心臟疾病中的保護作用，建立了阿霉素誘導的急性心臟毒性模型（圖 S1A）。C57BL/6 小鼠在阿霉素給藥前一天和給藥后一天分別接受 DcR2-Fc 或 PBS 的靜脈注射，PBS 作為對照。超聲心動圖結果顯示，與正常組相比，阿霉素組小鼠的左心室射血分數（EF%）和短軸縮短率（FS%）顯著降低（圖 S1B-C）。然而，與阿霉素組相比，接受 hDcR2-Fc 治療的小鼠心臟功能得以良好維持。蛋白質印跡分析顯示，阿霉素處理的小鼠心臟組織中促凋亡蛋白 Bax 的表達顯著增加，而抗凋亡蛋白 BCL2 的表達顯著降低（圖 S1D）。此外，hDcR2-Fc 逆轉了這些表型。這些結果表明，DcR2 通過抑制細胞凋亡的內在和外在途徑的激活，在心臟保護中發揮著作用。

為了確定 PLAD 是否介導 DcR2 與 DR5 的結合，我們制備了 PLAD 結構域缺失的 DcR2ΔPLAD-Fc 融合蛋白。PLAD 結構域的去除并未影響DcR2 的二級結構，但其熔解溫度（Tm）略有下降，表明其穩定性有所減弱。隨后測定 DcR2APLAD-Fc 與 TRAIL 的親和力為 4.724×10-7 M，略低于野生型。細胞凋亡阻斷實驗的結果表明，去除 PLAD 結構域后 DcR2 無法阻斷細胞凋亡，這證實了 PLAD 結構域的重要性。相關通路。促凋亡蛋白裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8、Bak 和 Bax 的表達顯著增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達則顯著降低（圖 2G-I）。此外，hDcR2-Fc 可逆轉這些表型。通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記（TUNEL）檢測和 HE 染色來檢測心肌梗死組織中的細胞凋亡情況并評估病理變化（圖 2J）。與假手術組相比，心肌缺血/再灌注損傷后凋亡心肌細胞的數量顯著增加，而使用 hDcR2-Fc 治療則顯著減少了凋亡心肌細胞的數量。總之，結果表明 hDcR2-Fc 可通過內在和外在途徑抑制細胞凋亡的激活。

為了通過抑制細胞凋亡來確定 DcR2-Fc 在其他心臟疾病中的保護作用，建立了阿霉素誘導的急性心臟毒性模型（圖 S1A）。C57BL/6 小鼠在阿霉素給藥前一天和給藥后一天分別接受 DcR2-Fc 或 PBS 的靜脈注射，PBS 作為對照。超聲心動圖結果顯示，與正常組相比，阿霉素組小鼠的左心室射血分數（EF%）和短軸縮短率（FS%）顯著降低（圖 S1B-C）。然而，與阿霉素組相比，接受 hDcR2-Fc 治療的小鼠心臟功能得以良好維持。蛋白質印跡分析顯示，阿霉素處理的小鼠心臟組織中促凋亡蛋白 Bax 的表達顯著增加，而抗凋亡蛋白 BCL2 的表達顯著降低（圖 S1D）。此外，hDcR2-Fc 逆轉了這些表型。這些結果表明，DcR2 通過抑制細胞凋亡的內在和外在途徑的激活，在心臟保護中發揮著作用。

3.4. DcR2 與 DR5 的親和力大于 DcR2 與 TRAIL 的親和力

DcR2 最初被發現是 TRAIL 的誘騙受體，因為它與 DR4 和 DR5 競爭 TRAIL 結合位點[19]。然而，由于 DcR2 與 TRAIL 的親和力較低，它可能無法實現競爭性結合。近年來，越來越多的研究表明，DcR2 是一種“調節性"而非“誘餌"受體，它通過與 DR5 結合形成不依賴配體的異源復合物來抑制細胞凋亡信號傳導[14-16]。在此，我們通過生物膜干涉（BLI）技術檢測了 DcR2 對 TRAIL/DR5 的親和力（圖 3）。人 DR5-Fc（hDR5-Fc）與人 TRAIL（hTRAIL）以典型的慢結合/慢解離動力學相結合（kon = 5.364 ×10-4 M?1 s?1，koff = 4.160 ×10?7 s?1)，平衡解離常數（KD）測定為 7.755 ×10?12 M（圖 3A、F）。DR5-Fc 與小鼠 TRAIL（mTRAIL）的結合親和力（KD）計算為 4.389 ×10?8 M（圖 3B）。帶有 C 末端 His 標簽的 DcR2 蛋白從 293F 細胞中表達并純化。DcR2 與 hDR5 的結合常數（Kd）計算為 5.301 ? M（圖 3C），DcR2 與 hTRAIL 之間的相互作用親和力為 3.066 ? M（圖 3D）。這些結果表明，DcR2 對 DR5 的親和力大于對 TRAIL 的親和力，推測 DcR2 可能傾向于與 DR5 結合。為了更好地分析小鼠 I/R 損傷模型中的實驗結果，我們測試了不同物種之間的親和力，發現 DcR2 與 mTRAIL 的親和力為 6.123 ? M（圖 3E），這比 hDR5 與 mTRAIL 的親和力大得多。蛋白質序列比對結果顯示，小鼠 TRAIL 受體 mTRAIL-R 與 DcR2 的同源性高于與 hDR5 的同源性。這一發現也可以解釋在小鼠 I/R 損傷模型中，較低劑量的 hDcR2-Fc 融合蛋白（8 mg/kg）比 hDR5-Fc（30 mg/kg）具有更好的心臟保護作用。

3.5. 在缺血/再灌注損傷中，DcR2 與 DR5 之間的配體非依賴性相互作用抑制了 TRAIL 誘導的細胞凋亡

先前的研究表明，DcR2 和 DR5 可能通過 PLAD 結構域結合。DR5 三聚體復合物的結構顯示，在一個結構模型中存在兩個不重疊的相互作用界面[20]。界面 1 的特征是單個單體的 CRD1 插入到相鄰單體的拱形結構中（圖 4A）。界面 2 的特征是單個單體的 CRD2 和 CRD3 分別與另一個單體的 CRD2 和 CRD1 相互作用（圖 4A）。CRD1 是介導配體前聚集的主要 PLAD，參與了界面 1 和界面 2，盡管 CRD2 和 CRD3 也參與了分子間的相互作用（圖 4B）。此外，DR5/DcR2 自關聯復合物的形成掩蓋了與配體 TRAIL 相互作用的位點。上述結構數據分析表明，PLAD 是 DR5 自關聯的關鍵區域。DR5-TRAIL 復合物的 3:3 三維結構顯示，三個 sDR5 分子之間沒有相互作用，它們圍繞著同源三聚體 TRAIL 以三角形位置排列（圖 4C）。DR5 上的兩個環，即 CRD2 中的 50s 環（殘基 51 - 65）和 CRD3 中的 90s 環（殘基 91 - 104），介導了與 TRAIL 的大部分相互作用，而 CRD1 或 PLAD 并不參與受體 - 配體的相互作用[21]。蛋白質序列比對結果還顯示，DcR2 的 CDR1 區域與 DR5 的同源性更大（圖 4D）。

為了確定 PLAD 是否介導 DcR2 與 DR5 的結合，我們制備了 PLAD 結構域缺失的 DcR2ΔPLAD-Fc 融合蛋白（圖 5A）。PLAD 結構域的去除并未影響DcR2 的二級結構，但其熔解溫度（Tm）略有下降，表明其穩定性有所減弱（圖 5B）。隨后測定 DcR2APLAD-Fc 與 TRAIL 的親和力為 4.724×10-7 M，略低于野生型（圖 5C）。Jurkat 細胞凋亡阻斷實驗的結果表明，去除 PLAD 結構域后 DcR2 無法阻斷細胞凋亡，這證實了 PLAD 結構域的重要性（圖 5D）。我們進一步研究了 DcR2APLAD-Fc 融合蛋白在小鼠心肌缺血/再灌注損傷模型中的作用。令人驚訝的是，我們的研究結果表明，刪除 PLAD 結構域消除了 DCR2-Fc 對缺血/再灌注所致心肌損傷的保護作用（圖 5E-F）。綜上所述，這些結果表明 DcR2 通過其 PLAD 結構域與 DR5 形成異源復合物，從而阻斷缺血誘導的細胞凋亡，保護心臟免受損傷。

3.6. N-糖基化缺陷的 DCR2 仍能阻斷細胞凋亡

目前，關于 DcR2 糖基化作用的研究尚不充分，糖基化如何調節 TRAIL 誘導的細胞凋亡以及 DcR2 與受體和配體的結合機制仍不清楚。由于 N 連接糖基化（N-糖基化）在腫瘤壞死因子（TNF）家族的其他成員中起著調節作用，我們研究了 N-糖基化對 DcR2 功能的調節作用[22,23]。雖然人類 DR5 序列中沒有潛在的 N-糖基化位點，但人類 DR4 的 CRD2 區域在 156 位的天冬酰胺上存在 N-糖基化（22）。DeR2 在 95、139 和 150 位的三個天冬酰胺上具有三個潛在的 N-糖基化位點（圖 4D）。為了探究 N-糖基化對 DeR2 功能的影響，將 DCR2 的三個 N-糖基化位點從天冬酰胺突變為谷氨酰胺（圖 6A）。首先，測試了蛋白的穩定性，熱變性曲線顯示突變后 Tm 值略有下降（圖 6B）。接下來，N-糖基化缺陷型 DcR2 對人 TRAIL 的親和力為 2.088×10-7 M，比野生型低一個數量級（圖 6C）。N-糖基化缺陷型 DR2 蛋白仍能阻斷 TRAIL 誘導的細胞凋亡（圖 6D）。無論 DCR2 是否發生 N-糖基化，對 DeR2 功能的影響都很小，這表明可以繼續開展 DcR2 的藥物研究與開發工作。

作者進一步借助蛋白穩定性分析儀PSA-16，通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩定性分析，結果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現出相似的熱穩定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對其結構穩定性沒有顯著影響。

由于NiV G-ferritin可以誘導強大的體液免疫反應，研究者還從NiV G-ferritin免疫小鼠體內篩選、制備了一批單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）。在分離的27種mAbs中，25種mAbs可以有效抑制水皰性口炎病毒（VSV）為骨架的NiV假病毒的感染，其抑制50%的NiV假病毒感染所需要的濃度（IC50）低于10 ng/mL。表位競爭分析發現，篩選得到的27個mAbs可以識別NiV G蛋白上4個不同的抗原表位，包括2個新的此前未被報道的表位。最后，研究者在尼帕病毒感染的致死模型（敘利亞金黃倉鼠）上評估了NiV G-ferritin誘導的免疫反應和保護效果。研究發現給與倉鼠2針或者3針的NiV G-ferritin后，倉鼠體內均產生了高中和活性的血清，且接種2次或者3次均能夠幫助倉鼠100%的抵抗致死劑量NiV的攻擊。研究者進一步檢測了3針疫苗接種倉鼠體內的病毒RNA含量，結果發現，倉鼠的肺臟、腦和脾臟中均未檢測到病毒RNA，表明三劑NiV G-ferritin抑制了病毒在倉鼠肺部、大腦和脾臟的復制。

04 討論

本研究證明了 DcR2 在減輕 1/R 誘導的心臟損傷方面具有顯著效果，并揭示了在小鼠 1/R 損傷疾病模型中，DcR2 更傾向于與 DR5 結合。為開展此項研究，我們表達并純化了一系列蛋白質，包括 hDcR2-Fc、Fc-hDcR2、DR5-Fc、DR5-His、TRAIL、DCR2APLAD-Fc 和 Mu-N-Gly-DcR2-Fc（圖 1A-D）。通過蛋白質特性分析，我們確定 hDcR2-Fc 具有更強的抗凋亡作用（圖 1E）。在雙盲條件下進行的小鼠心肌 1/R 損傷實驗結果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白通過減少心肌細胞凋亡程度發揮心臟保護作用（圖 2）。先前的研究報告稱，DcR2 還可作為 DR5 的配體，在體外阻斷 TRAIL 誘導的細胞凋亡，但這一發現尚未在體內得到驗證。我們的研究闡明了 DcR2 與 DR5 的親和力大于其與 TRAIL 的親和力，且 DcR2 更傾向于與 DR5 結合（圖 3）。深入研究其機制后，我們發現 DcR2 通過類似的 PLAD 結構域與 DR5 形成異源復合物（圖 4）。由于缺乏完整的死亡結構域，DeR2-DR5 復合物無法激活下游的細胞凋亡信號，從而有效減輕了 1/R 引起的心臟損傷（圖 5）。此外，我們對 DeR2 的 N 糖基化位點進行了突變，發現未進行 N 糖基化的 DeR2 蛋白仍能阻斷細胞凋亡（圖 6）?？傊?，本研究為治療心肌 1/R 損傷提供了新的治療靶點。
我們之前已證實 DR5-Fc 融合蛋白可通過靶向 TRAIL 來阻斷細胞凋亡并發揮心臟保護作用[11,24]。在本研究中，我們進一步證明了通過靶向 DR5，DCR2通過與 DRS 形成無功能的異三聚體來阻止細胞凋亡。針對 TRAIL-DR5 通路的臨床藥物研發有所增加[25-27]。人類 TRAIL 有 5 種受體。過去，人們認為死亡受體 DR5 和 DR4 起主要作用，而對其他誘騙受體關注較少。我們的研究表明，在病理狀態下，應更多地關注 TRAIL 的幾種受體是如何平衡的。TRAIL 被認為是腫瘤治療的治療靶點，因為它能選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無影響。目前，僅有一種藥物——環化突變型 TRAIL（CPT）于 2023 年獲批，而針對 TRAIL 開發藥物的主要困難在于克服其耐藥性[28]。多項研究將 TRAIL 耐藥性與死亡受體和誘騙受體的比例改變聯系起來，DR4/DR5 表達降低和誘騙受體表達增加可能導致 TRAIL 耐藥性的產生[29-31]。我們的研究還表明，DcR2 的功能不容忽視。有必要進一步研究 DcR2 在癌癥和其他疾病中的作用。

DcR2 的 PLAD 結構域是如何發揮作用的？作為一種死亡受體，DcR2 屬于腫瘤壞死因子受體超家族，但與 TNFRI 及其他成員有所不同。首先，TNFR1 有四個 CRD 結構域，每個結構域包含三個二硫鍵，共 6 個半胱氨酸。而 Fas 和 DR4/DR5/DcR1/DcR2 只有三個 CRD 結構域，且只有部分 CRD1。DR4/DR5/DcR1/DcR2 的 CRD1 結構域只有一個二硫鍵。腫瘤壞死因子受體的配體前組裝已被認為激活的必要前提。其他 TNFR 受體只能通過 PLAD 結構域自組裝，而不能與其他受體結合。然而，DR5 和 DcR2 能夠形成異三聚體復合物，因為 TNFR 家族成員在 CRD1 區域有更多的二硫鍵相互作用，而 DR4/DR5/DcR1/DcR2 在 CRD1 區域只有一個二硫鍵。此外，DR5 和 DcR2 的 CRD1 區域較短，且 DcR2 的 PLAD 結構域與 DRS 相似，因此它們能夠形成復合物。還需要進一步研究來探索其中的詳細機制。此外，我們還研究了 N-糖基化對 DCR2 功能的影響，并報告稱未進行 N-糖基化的 DCR2 蛋白仍能發揮阻斷細胞凋亡的作用，這為開發 DcR2 相關藥物奠定了基礎。

我們的研究存在一些局限性。在小鼠心肌缺血/再灌注損傷模型中證實了 hDcR2-Fc 的心臟保護作用，但小鼠誘騙受體 2（mDCTRAIL-R2）的氨基酸序列與人 DCR2 差異很大，僅有 27.37% 的同源性[32,33]。此外，小鼠 TRAIL 與人受體的相互作用很強[34]。由于猴和人的 TRAIL/TRAIL 受體具有高度相似性（84-99% 的同源性）[35]，有必要進一步在猴缺血/再灌注模型中探究 hDCR2-Fc 蛋白的心臟保護作用。hDCR2-Fc 在心肌缺血/再灌注損傷中的具體靶細胞尚未明確，還需要進一步研究以確定 DCR2-Fc 對關鍵心臟細胞（包括心肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞）的影響。已發現 DR5 的 O 連接糖基化（O-glyc）可調節促凋亡信號，DR5 的 O-glyc 位點位于 CRD2 和 CRD3 內或其周圍[22,23,36]。通過 NetOGlyc 預測 DCR2 的 O-glyc 位點，發現 DCR2 比 DR5 擁有更多的 O-glyc 位點，尤其是在 CRD1 區域。闡明 O-糖基化在 DeR 中的作用將是未來研究的有趣方向。

總之，我們的研究證明了 DCR2 在減輕急性心肌梗死后的再灌注損傷方面具有保護作用。機制研究闡明，DCR2 通過其 PLAD 結構域與 DR5 形成異源復合物，該結構域不具有完整的死亡結構域，因而無法誘導細胞凋亡級聯反應。此外，復合物的形成掩蓋了與配體 TRAIL 的結合位點，從而減輕了再灌注損傷后的心肌細胞死亡。本研究證實了針對 DR5 進行靶向治療的可行性，并為開發針對 TRAIL-DRS 通路的臨床藥物提供了更廣闊的發展空間。