為了彌補動物模型的局限性，提出了新的藥物安全性評估模型，以完善和減少現有的模型。為了在體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)（MPS）中模擬藥物的吸收和代謝，并預測藥代動力學和毒性效應，中國食品藥品檢定研究院安全評價研究所（國家藥物安全評價監(jiān)測中心），中國醫(yī)學科學院 & 北京協和醫(yī)學院，德國TissUse GmbH公司的科學家一起合作，建立了一個腸-肝臟串聯培養(yǎng)芯片，檢測了APAP（對乙酰氨基酚）過量后的急性肝臟損傷過程，并于2024年9月發(fā)表于《Food and Chemical Toxicology》雜志。

使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細胞系建立了腸類器官，同時利用 HepG2、HUVEC-T1 和經 PMA 誘導的 THP-1 以及人類肝臟星狀細胞建立了肝臟類器官。使用高效液相色譜法測定 APAP 濃度，并使用 Phoenix 軟件通過非房室分析法擬合藥代動力學參數。肝臟損傷生物標志物天冬氨酸轉氨酶和丙氨酸轉氨酶的變化，以及肝臟功能標志物白蛋白表明，這兩個器官芯片模型在 4 天內的短期培養(yǎng)是穩(wěn)定的。在給藥對乙酰氨基酚（APAP）后，活性氧信號增強，同時線粒體膜電位降低，caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）被激活，p53 信號增強，表明 APAP 過量引發(fā)了毒性反應。在腸肝臟多器官系統(tǒng)模型中，我們擬合了毒代動力學參數，并模擬了 APAP 過量后的肝臟毒性過程，這將有助于器官芯片在藥物毒性檢測中的應用。

1. 引言

藥物性肝臟損傷（DILI）是藥物研發(fā)的主要障礙，會導致藥物撤市（2021 年；2016 年）。動物模型與人體之間的差異以及日益嚴格的倫理要求，使得有必要采用新的藥物安全性評估模型（2014 年）。這種微生理系統(tǒng)（MPS），也稱為“芯片上的器官"，是一種通過結合微流控、微制造和三維（3D）細胞培養(yǎng)構建的裝置。它能夠為動物模型重現生理相關的器官功能。MPS平臺是一種微型化的體外生理環(huán)境（Shinohara等，2021）。

這使得能夠模擬和精確控制化學梯度和生物力學力，以模擬體內環(huán)境并響應。預定義的微流控通道充當工程化的血管，重現體內生理組織功能（Low 等，2020 年），并允許與其他多器官系統(tǒng)聯合（Kulthong 等，2020 年）。此外，多器官系統(tǒng)能夠實現實時組織功能監(jiān)測（Milani 等，2022 年）。

由微流道串聯的多器官芯片模型能夠進一步模擬人類動態(tài)反應和內部器官相互作用（Arakawa 等，2020 年），并為藥物暴露與藥物效果/毒性的關系提供輔助證據。腸和肝臟是主要的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）器官，因此在藥代動力學（PK）研究中非常重要（Vernetti 等，2017 年）。

口服藥物通過消化道和腸直接吸收進入血液，影響藥物的生物利用度和全身劑量。腸芯片模型可以模擬藥物吸收，并描繪藥物的 ADME 和血藥濃度（Milani 等，2022 年）。Lee 等（2017 年）建立了一個三維腸肝臟芯片來描繪對乙酰氨基酚（APAP）的藥代動力學模型，而 Arakawa 等（2020 年）構建了一個腸-肝臟模型，用于SAN唑侖的連續(xù)代謝的體外定量推算。Milani 等（2022 年）評估了由于腸和肝臟對麥考酚酯代謝而產生的藥物前體麥考酚酯的量。因此，類似的方法可以應用于其他多器官的 MPS，以研究人體內的藥效學過程。

目前僅有少數關于同時進行毒性檢測和樣本鑒定的多器官芯片系統(tǒng)的例子被報道。Liu等（2020 年）基于基于腸、血管、肝臟和腎臟芯片的多器官芯片系統(tǒng)研究了人參皂苷復合物 K 的吸收、代謝和毒性。Jeon等（2021 年）報道了一種腸肝臟芯片，重現了脂肪酸的吸收以及隨后在肝臟中的脂質積累。

為了探索體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)，在此，我們通過將腸培養(yǎng)物與使用四種細胞系構建的 3D 肝臟球體串聯在二聯器官芯片（2OC）上，開發(fā)了一種可重復的腸-肝臟的二聯器官芯片。我們通過檢測功能生物標志物和蛋白質的水平來剖析芯片功能，然后在芯片中通過向腸腔室添加肝臟毒性化合物對乙酰氨基酚（APAP）來測試肝臟毒性，以模擬藥物吸收后的肝臟毒性。經過 48 小時的孵育，檢測了兩個腔室中的藥物分布和肝臟毒性信號。

2. 材料和方法

2.1. 細胞與培養(yǎng) 細胞資源及培養(yǎng)方法見補充信息。

2.2. 腸的培養(yǎng)

為了在 Transwell 培養(yǎng)板上構建腸模型，以 1 ×10-6 細胞/孔的密度將 Caco-2 細胞接種到 Transwell 培養(yǎng)板（默克公司，PIHP01250）中。將 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細胞以 9:1 的比例混合，并以相同的濃度接種到每個培養(yǎng)板中。從第 0 天到第 7 天，每兩天更換一次培養(yǎng)基，第 7 天之后每天更換一次。

2.3. 3D（肝臟）的培養(yǎng)

基于我們之前的研究（Sun 等，2024 年），THP-1 細胞在 RPMI 1640 培養(yǎng)基中稀釋至 5 ×10-5 細胞/毫升，然后用 25 納摩爾的佛波酯酰基乙酸（PMA，MedChemExpress）處理 48 小時，在 6 孔板中進行。隨后在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 小時并用 TryplE（Gibco）進行篩選，經 PMA 誘導的 THP-1 細胞被收集。   2   HepG2、人臍靜脈內皮細胞 T1、THP-1 以及人類肝臟星狀細胞（HHSC）消化后收集，細胞懸液以 60:19:15:6 的比例混合。為了形成等量細胞，稀釋后每孔接種 100 個細胞到圓底 U 型低貼壁 96 孔板（深圳肝臟生物技術有限公司，LV-ULA002-96UW）中。每兩天更換一半培養(yǎng)基。 使用高內涵細胞成像分析儀（珀金埃爾默公司，Opretta 系列）對球形形態(tài)進行了觀察和測量。

2.4. 基于芯片的腸-肝臟共培養(yǎng)

HUMIMIC Chip2 24 孔板（德國 TissUse GmbH）是按照推薦方案（Wagner 等，2013 年）制備的。在腸模型建立后的第 14 天，將 Transwell 細胞嵌體添加到 24 孔培養(yǎng)室中，并將 50 個球體添加到 96 孔培養(yǎng)室中，以形成腸-肝臟芯片模型。

根據之前的方法（Lin 等，2020 年），在2OC 微流道循環(huán)中，使用600 ul循環(huán)培養(yǎng)基和 400 ul位于屏障頂部的培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)。

肝臟腔室中的培養(yǎng)基每天更換一次，并且收集并更換一半的循環(huán)上清液。在 7 天共培養(yǎng)結束時，使用免疫熒光法分析肝臟的器官特異性功能標志物。將片上微流泵設置為 0.8 Hz的頻率。

2.5. 腸類器官的完整性

在不同時間點測量熒光素鈉和 40 kDa熒光異硫氰酸熒光素 - 葡聚糖的跨內皮電阻（TEER）和腸表觀通透性系數（Papp），以評估腸類器官的完整性。方法見補充信息。

2.6. 肝臟類器官的性能評估

在肝臟模型中，選擇了一種靈敏的雙色熒光細胞活力測定法來區(qū)分活細胞和死細胞。使用鈣黃綠熒光素 AM（一種細胞可滲透染料）作為活細胞指示物，使用碘化 BOBO-3（Invitrogen 公司）作為死細胞指示物。活細胞成分在活細胞中產生強烈、均勻的綠色熒光（激發(fā)/發(fā)射 488 納米/515 納米），而死細胞成分主要產生細胞核紅色熒光（激發(fā)/發(fā)射 570 納米/602 納米）。 在使用建立的肝臟器官芯片模型獲得的上清液中測量了各種生物標志物。我們評估了白蛋白（ALB）、尿素（UREA）、天冬氨酸轉氨酶（AST）和丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平，這些是肝臟代謝和損傷的指標。根據制造商的說明，使用 Cell Titor Glo 3D（Promega）測量了三磷酸腺苷（ATP）的含量。 膽酰基-賴氨酸-熒光素（CLF）是一種熒光素標記的膽汁酸，其生物學行為與天然膽酰基甘氨酸非常相似。為了在三維肝臟模型中可視化膽管，我們制備了 20 微摩爾的 CLF 儲備液，并將模型在 37°C 下孵育 2 小時。用 Hoechst 33342 染色并孵育 10 分鐘。細胞用無酚紅培養(yǎng)基沖洗三次，并在激發(fā)/發(fā)射波長為 498/517 納米處檢測熒光信號。

2.7. 形態(tài)學與免疫染色

如前所述（Sun 等，2024 年），腸和肝臟的等量切片用多聚甲醛固定，并用蔗糖溶液脫水。冷凍切片在染色前先用蘇木精-伊紅（HE）染色、高碘酸-希夫（PAS）染色或免疫染色進行切割。對于免疫染色，切片先用 PBS 沖洗三次     用含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 處理細胞，處理時間及穿孔處理 10 分鐘，用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘，在室溫下進行。按照說明書以一定稀釋度向每個孔中加入一抗原位體，并在 4℃下孵育過夜。使用以下一抗原位體：抗 Occludin（91131S，CST，1:400 稀釋度）、抗 ZO-1（ab221547，Abcam，1:100 稀釋度）、抗 MRP2（ab172630，Abcam，1:500 稀釋度）和抗 PGP（貨號 25081-2-AP，ProteinTech，1:500 稀釋度）。清洗細胞，用相應的熒光偶聯二抗原位體處理，并與 DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用高內涵細胞成像分析儀或顯微鏡（奧林巴斯 IX71）觀察明視野形態(tài)和切片。 對于原位免疫熒光染色，腸膜和 3D 肝臟模型用 PBS 沖洗三次，并用 4%多聚甲醛固定 30 分鐘。接下來，樣本在含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 中穿孔處理 10 分鐘，并在室溫下用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘。 按照說明書，將稀釋后的原位抗體以一定稀釋度加入每個孔中，并在4℃下孵育過夜。使用的原位抗體包括：抗Occludin（91131S，CST，1:400稀釋）、抗ZO-1（sc-33725，Santa Cruz Biotechnology，1:500稀釋）、抗MRP2（ab172630，Abcam，1:500稀釋）、抗ABCB11/BSEP（ab255605，Abcam，1:100稀釋）、抗PGP（Cat No. 25081-2-AP，ProteinTech，1:500稀釋）、抗CYP3A4（MA5-17064，ThermoFisher，1:1000稀釋）、抗Ki67（9449S，CST，1:10,000稀釋）、抗CD31（3528S，CST，1:100稀釋）、抗CD68（ab213363，Abcam，1:100稀釋）、抗SMA（14395-1-AP，ProteinTech，1:100稀釋）、抗裂解的caspase-3（9664S，CST，1:400稀釋）和抗p53（2524S，CST，1:2000稀釋）。細胞經過洗滌，與熒光偶聯的次級抗體孵育，并與DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用的次級抗體包括：山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150077，Abcam，1:1,000稀釋）、山羊抗鼠IgG（H + L）（Alexa Fluor® 555 Conjugate）（4417，CST，1:1000稀釋）和山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150113，Abcam，1:1,000稀釋）。結果通過高含量分析和熒光顯微鏡進行評估。

2.8. 藥物毒性和細胞活力測定

如前所述（Sun 等，2024 年），使用 Cell Titor Glo 檢測細胞活力，并測定細胞存活率和細胞存活率（%）。在 96 孔板中，以 1 ×10-4細胞/孔的密度將細胞接種到 96 孔板中；次日丟棄上清液，并與對乙酰氨基酚（4 毫摩爾）一起培養(yǎng)。使用同樣的方法測定球體的存活率。該檢測使用光度計進行。

2.9. 阿司匹林在共培養(yǎng)芯片中的模擬口服過程

加載了 7 個 2OC 模型，其中 4 個微流道給藥對乙酰氨基酚（APAP），其余回路未給予。為了模擬口服過程以及 APAP 誘導的肝臟毒性后果，在加載 2OC 回路后的第二天，向插入物頂部加入 400 微升 10 毫摩爾的 APAP。在 0、0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時分別收集 10 微升上清液用于液相色譜定量分析。在給藥 48 小時后，收集上清液用于各種生物標志物的測量以評估透皮電阻（TEER）。同時收集肝臟球體用于肝臟毒性評估。我們還至少收集了 3 - 5 個用于細胞活力測定，其余部分轉移到 96 孔板中保存以用于熒光染色。

2.10. 共培養(yǎng)芯片的肝臟毒性評估

根據推薦的試劑盒方案，測量細胞活力以及白蛋白（ALB）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平，以評估藥物給藥 48 小時后的肝臟損傷情況。使用線粒體膜電位檢測試劑盒（Beyotime Biotechnology，C2001S）進行測定線粒體膜電位。將 2OC 芯片的 3D 包埋肝臟模型轉移到 96 孔板中。分別在 Ex/Em = 550/575 和 350/461 納米檢測四甲基羅丹明乙酯（TMRE）和 Hoechst 33342 的熒光信號。使用 CellROX 氧化應激試劑（賽默飛世爾科技，C10444）測定氧化應激。 將 2OC 芯片的 3D 嵌入式肝臟模型轉移到 96 孔板中。分別在 485/520 納米和 350/461 納米檢測 CellROX 和 Hoechst 33342 的熒光信號。使用免疫熒光染色法檢測原位 Ki-67、裂解的 caspase-3 和 p53 信號，以評估細胞增殖能力和細胞凋亡情況。

2.11. 樣本定量

基于之前的方法（Marin 等，2019 年），使用高效液相色譜法（HPLC）（島津，LC-2040C 3D）測量對乙酰氨基酚（APAP）的濃度。基底側腔室（肝臟腔室）用新鮮培養(yǎng)基填充，而頂側腔室暴露在對乙酰氨基酚培養(yǎng)基中。在每個時間點，如第 2.9 節(jié)所述，從兩側各取 10 微升樣本。選擇甲醇作為蛋白質沉淀劑，在加入 30 微升甲醇以沉淀蛋白質后，通過離心機（13000 轉/分鐘，4℃，15 分鐘）去除沉淀物。使用惰性可持續(xù) C18（150 毫米長度，內徑 4.6 毫米，粒徑 5 微米，島津）色譜柱。使用兩種流動相：溶劑 A（甲醇）和溶劑 B（蒸餾水），流速為 0.8 毫升/分鐘。溶劑組成在 0 - 4 分鐘為 5% A，4.01 - 10 分鐘為 5 - 100% A，10.01 - 15 分鐘為 5% A。進樣量為 10 微升，檢測使用光電二極管陣列（PDA）檢測器（波長 280 納米）。使用標準曲線測定對乙酰氨基酚的濃度。 藥代動力學參數使用非房室模型（NCA）在 Phoenix WinNonlin（Certara，美國）中進行擬合。采用線性梯形線性插值法作為計算方法，模型類型定義為血漿，劑量選項定義為血管外。通過高效液相色譜法測定的肝臟隔室中的對乙酰氨基酚（APAP）濃度 - 時間數據進行擬合，以確定 0 至 48 小時下的曲線下面積（AUC）。峰值濃度（Cmax）和達峰時間（Tmax）直接從個體濃度與時間曲線中讀取（高等，2022 年；王等，2022 年）。 采用超高效液相色譜 - 串聯質譜法（UPLC-MS）檢測 NAPQI 的信號（張等，2018 年）。通過將 N-乙酰基對苯二酚亞胺（NAPQI）（MCE，HY-66005）溶解在甲醇中制備濃度為 1 毫克/毫升的儲備溶液，并用甲醇進一步稀釋至 1 微克/毫升的工作溶液。對 NAPQI 的形成進行了分析。 在服用對乙酰氨基酚（APAP）后 0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時，使用配備 AB SCIEX LC AC 系統(tǒng)、PDA 檢測器和三重四極桿 6600+儀器的超高效液相色譜 - 質譜法（UPLC-MS）進行檢測。通過使用沃特斯 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 毫米×50 毫米）實現了色譜分離。 1.7 微米）。使用的洗脫液為（A）0.1%（體積比）的甲酸水溶液和（B）甲醇，采用梯度洗脫程序進行分離，如表S1所示。超高效液相色譜流速為0.3 mL/min，超高效液相色譜-質譜分析使用10 微升樣品。對應于解聚電位、碰撞能量、碰撞能量分布和溫度的離子對特征為m/z 149.98-108.04（30、30、15和350），對應于NAPQI。

2.12. 統(tǒng)計分析

連續(xù)變量以均值±偏差（標準差）表示。采用雙尾學生 t 檢驗來研究兩個獨立樣本之間的差異。數據分析使用 IBM SPSS Statistics 25 版（IBM 公司）進行。線性回歸模型使用 SPSS 和 GraphPad Prism 7.00（GraphPad 軟件）進行。統(tǒng)計學意義設定為 P≤0.05。

3. 結果

3.1. 類器官的培養(yǎng)

將細胞混合物以 1 ×10-6、5 ×10-5 和 2.5 ×10-5 個細胞/孔的密度接種到 Transwell 培養(yǎng)板中，以獲得體外腸模型。所有組的跨上皮電阻（TEER）在 21 天內均達到 300 Ω cm2，其中高密度共培養(yǎng)組在 12 天內達到 300 Ω cm2（圖 1A）。在第 14 天，高密度共培養(yǎng)組模型中熒光素鈉和熒光素葡聚糖均符合滲透性測試要求（圖 1B）。當跨上皮電阻達到 200 - 1000 Ω cm2 時，Caco - 2 單層可被視為完整（Iftikhar 等，2020 年）。在后續(xù)實驗中，選擇高密度共培養(yǎng)組來形成腸屏障。 緊密連接蛋白 Occludin 和 ZO-1 經過染色，以顯示其在腸等值物培養(yǎng)條件下的完整性。在第 7 天和第 21 天，我們觀察到 Occludin 的連續(xù)網絡結構（圖 1C），而在第 14 天和第 21 天的切片中，Occludin 和 ZO-1 呈網狀結構（圖 1D，圖 S1A），表明在第 14 天腸屏障被視為完整的。在第 14 天和第 21    天，轉運蛋白 MRP2 和 PGP 分布在腸切片的一側（圖 1E，圖 S1B），表明腸模型的極性。總體而言，結果表明在第 14 天獲得的腸等值物具有緊密連接和極性；因此，在第 14 天腸屏障被視為成熟的，并用于進一步的實驗。 在圖 2A 中，模型的直徑在 10 天內迅速增大，并穩(wěn)定在約 400 微米。HE 染色顯示在第 7 天（圖 2B）沒有明顯的壞死核心，但在第 10 天（圖 2B）有輕度壞死核心或幾個細胞凋亡，在第 14 天（圖 S1I）有嚴重的中心壞死區(qū)域。與活/死細胞染色（圖 2C）所示的死細胞分布一致，在第 10 天檢測到更多的死細胞。模型中 ATP 的總量持續(xù)增加（圖 S1C），而乳酸脫氫酶（LDH）的分泌沒有顯著增加（圖 S1D）。模型穩(wěn)定生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，壞死細胞數量增加，通過檢測上清液中的 LDH 水平無法檢測到內部壞死細胞。為避免壞死細胞核的形成，這些結果表明培養(yǎng)時間限制為 7 天。 在第 7 天（圖 2D）和第 10 天，分別通過 CD31、CD68 和α-SMA 信號來追蹤人臍靜脈內皮細胞 T1（HUVEC-T1）、人肺泡巨噬細胞 THP-1 和人肝臟星狀細胞 HHSC 的熒光信號，采用免疫熒光染色法進行追蹤。

圖 S1G 表明，上述三種細胞類型在第 10 天仍存在于球體中。在第 7 天檢測了轉運蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP（圖 2E），并通過熒光探針 CLF 追蹤了膽汁酸外排的功能（圖 S1H）。CLF 是 MRP2 和 BSEP 的底物（Boaglio 等，2010 年），CLF 信號也表明了這些轉運蛋白在類器官中的功能。   最后，PAS 染色顯示有糖原沉積（圖 2B），ALB 和 UREA 的增加趨勢表明，即使在細胞死亡緊急情況下，肝臟的總合成代謝功能也未受阻礙（圖 S1E - F）。這些結果表明，在 14 天內，類器官對肝臟功能的影響相對穩(wěn)定。

111