應(yīng)用案例（質(zhì)量光度計）：質(zhì)量光度計在核酸方面的應(yīng)用

Mass photometry of nucleic acids

翻譯整理：北京佰司特科技有限責(zé)任公司

質(zhì)量光度法可以定量測定溶液中生物分子的質(zhì)量分布。它用于分析蛋白質(zhì)的純度，表征他們的低聚態(tài)和定量他們的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是建立的。然而，它在表征其他生物分子(包括核酸)方面的應(yīng)用研究較少。在這里，我們展示了如何使用質(zhì)量光度法來測量100到5000個堿基對范圍內(nèi)的DNA的質(zhì)量、大小和豐度。

質(zhì)量光度法(MP)是一種新的分析技術(shù)，它利用單個生物分子散射的光來測量它們的質(zhì)量。在MP測量中，當(dāng)分子遇到質(zhì)量光度計覆蓋的玻璃-水界面時，檢測到溶液中單個分子散射的微量光。散射光的量與分子的質(zhì)量成線性關(guān)系。因此，通過一個簡單的校準(zhǔn)，不同種類分子的分子質(zhì)量可以被精確地確定。

在這篇應(yīng)用筆記中，我們概述了如何應(yīng)用MP測量核酸，包括制備和校準(zhǔn)的步驟。我們還展示了從低質(zhì)量階梯到整個質(zhì)粒的DNA測量示例。

核酸測量的準(zhǔn)備工作

DNA和RNA在溶液中都帶負電荷，這意味著它們往往會被未處理的蓋玻片排斥。因此，核酸表現(xiàn)出很少和短暫的結(jié)合。這導(dǎo)致MP數(shù)據(jù)中很少且定義不明確的事件，解綁定的事件和綁定的事件一樣多(圖1)。

為了克服這種瞬態(tài)行為，覆蓋表面可以功能化成為帶正電荷的，增加它與帶負電荷的核酸的相互作用。為了實現(xiàn)這種功能化，玻璃表面可以用APTES2或聚賴氨酸(PLL)進行處理。

用鎖相環(huán)覆蓋在玻璃上大大增強了檢測能力，結(jié)合事件的數(shù)量顯著增加(解除結(jié)合的數(shù)量減少)(圖1)。低質(zhì)量DNA ladder的所有6個組成部分，跨度從100到2000個堿基對(63 kDa 到1242 kDa)。這說明MP可以用來測量溶液中核酸的質(zhì)量分布。

核酸質(zhì)量校準(zhǔn)

質(zhì)量光度法(MP)是一種新的分析技術(shù)，它利用單個生物分子散射的光來測量它們的質(zhì)量。在MP測量中，當(dāng)分子遇到質(zhì)量光度計覆蓋的玻璃-水界面時，檢測到溶液中單個分子散射的微量光。散射光的量與分子的質(zhì)量成線性關(guān)系。因此，通過一個簡單的校準(zhǔn)，不同種類分子的分子質(zhì)量可以被精確地確定。

在這篇應(yīng)用筆記中，我們概述了如何應(yīng)用MP測量核酸，包括制備和校準(zhǔn)的步驟。我們還展示了從低質(zhì)量階梯到整個質(zhì)粒的dna測量示例。

核酸測量的準(zhǔn)備工作

DNA和RNA在溶液中都帶負電荷，這意味著它們往往會被未處理的蓋玻片排斥。因此，核酸表現(xiàn)出很少和短暫的結(jié)合。這導(dǎo)致MP數(shù)據(jù)中很少且定義不明確的事件，解綁定的事件和綁定的事件一樣多(圖1)。

圖1未處理與功能化玻璃上核酸的測量值。DNA階梯疊加在未處理(中藍色)和聚賴氨酸涂層(灰色/深藍色)玻璃上。分子質(zhì)量(kDa)采用DNA校準(zhǔn)，假設(shè)一個堿基對等于660 Da。

為了克服這種瞬態(tài)行為，覆蓋表面可以功能化成為帶正電荷的，增加它與帶負電荷的核酸的相互作用。為了實現(xiàn)這種功能化，玻璃表面可以用APTES2或聚賴氨酸(PLL)進行處理。

用鎖相環(huán)覆蓋在玻璃上大大增強了檢測能力，結(jié)合事件的數(shù)量顯著增加(解除結(jié)合的數(shù)量減少)(圖1)。低質(zhì)量DNA ladder的所有6個組成部分，跨度從100到2000個堿基對(63 kDa)

1242 kDa)是很好的解決。這說明MP可以用來測量溶液中核酸的質(zhì)量分布。

核酸質(zhì)量校準(zhǔn)

圖2 DNA與蛋白質(zhì)校準(zhǔn)比較。不同的核苷酸和氨基酸折射率導(dǎo)致不同的DNA和蛋白質(zhì)校準(zhǔn)曲線的斜率。這并不影響測量，但影響分析物分子質(zhì)量的計算。

MP可應(yīng)用于多種生物分子。然而，不同類型的分子的折射率不同。因此，為了正確地將測量的對比與分子質(zhì)量相關(guān)聯(lián)，應(yīng)該使用已知質(zhì)量和與分析物相同分子類別的分子進行適當(dāng)?shù)男?zhǔn)。對不同分子類別的標(biāo)定均顯示出對比度和質(zhì)量之間普遍的線性相關(guān)關(guān)系，但斜率不同(圖2)。

至于校準(zhǔn)蛋白質(zhì)的測量，可用的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可用于校準(zhǔn)DNA的測量。凝膠電泳的DNA階梯(1堿基對= 660道爾頓)的一次測量就足以進行準(zhǔn)確的校準(zhǔn)(圖2)。通過這些簡單的準(zhǔn)備，MP可以用來測量未知成分的DNA樣品的質(zhì)量(或堿基對的數(shù)量)。

測量核酸

為了證明MP測量對核酸的實用性，我們使用最小樣本(3 ng)確定了PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和均勻性。測量結(jié)果顯示，在218 kDa處有一個對稱峰，相當(dāng)于331 bp(圖3)，與預(yù)期長度335 bp接近。

圖3 PCR產(chǎn)物驗證結(jié)果顯示其同源性。PCR產(chǎn)物的MP測定得到了分子量為218 kDa的單峰。用DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線進行校正，長度為331 bp(預(yù)期長度為335 bp)。

為了測試更大的DNA物種是否能夠以同樣的精度進行分析，我們測量了質(zhì)粒pUC18(圖4)。在2683 bp處觀察到豐富的峰，相當(dāng)于1773 kDa。檢測到的DNA片段長度約為5000 bp，短于1000 bp。

圖4質(zhì)粒的驗證顯示了質(zhì)粒的異質(zhì)性。質(zhì)粒pUC18的MP測定顯示一個主峰，分子量為1773 kDa。使用DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線進行校正，結(jié)果顯示完整質(zhì)粒的長度為2683 bp(預(yù)期長度: 2686bp)。同時檢測到高、低質(zhì)量的DNA種類。

這種測量突出了MP適用的寬質(zhì)量范圍，以及測量的單分子性質(zhì)所提供的高動態(tài)范圍。

綜上所述，MP是一種令人興奮的替代現(xiàn)有核酸定量技術(shù)。它允許使用非常少的樣品進行質(zhì)量測定和純度評估，只需幾分鐘，并且不需要任何污漬。

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